熒光從廣義上來說是指一種發(fā)光現象，分子發(fā)出的光。有幾種類型的發(fā)光。

光致發(fā)光是光能或光子激發(fā)光子的發(fā)射。

化學發(fā)光，定義為化學能激發(fā)光子的發(fā)光，這包括生物發(fā)光，如在螢火蟲和許多海洋生物中看到的。

電致發(fā)光，是當電能或強電場刺激光子的發(fā)射，例如在一些照明應用中。

具體來說，熒光是一種光致發(fā)光，光使電子處于激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)通過振動向環(huán)境迅速損失熱能，然后從最低的單線態(tài)激發(fā)態(tài)發(fā)射出光子。這個光子發(fā)射過程與其他非輻射過程競爭，包括能量傳遞和熱損失。

當使用“熒光”一詞時，同樣的測量方法通常適用于上述發(fā)光類別中的任何一種。

熒光粉末試劑

熒光測量是一種分析技術，利用物質在受到激發(fā)后發(fā)射出的熒光輻射的強度、衰減速率、壽命等特征，對物質進行分析和研究。熒光物質在特定波長的輻射能量輻射下，部分電子躍遷到高能級態(tài)，能發(fā)射出具有一定光譜分布的輻射，且一般都是在各個方向上輻射能量的散射光，并在短時間內通過非輻射躍遷或受激發(fā)射的方式，退回到低能級態(tài)，釋放出能量，并以熒光的形式輻射出來，產生熒光信號。

熒光光譜測量產生的熒光能量比激發(fā)光的光子能量小，只相當于激發(fā)光能量的3%左右，其靈敏度高、選擇性強、樣品用量少、方法簡便、具備環(huán)保性，可以反映物質的分子結構、電子能級結構等信息，熒光測量。熒光測量技術也因其高靈敏度、無創(chuàng)或微創(chuàng)等特點，適用于分析物質的結構、組成、含量、活性等方面，在材料（溶液、粉末、薄膜）科學、環(huán)境分析、生物分析、分子基因、細胞生物、醫(yī)療診斷和藥物篩選等多個領域中有著廣泛的應用。

常見熒光團在紫外和可見光譜上的熒光發(fā)射光譜

Fluorescence emission spectra of some common fluorophores across the UV and visible spectrum.

熒光染料吸收激發(fā)光的效率稱為分子消光系數。分子消光系數越大，給定波長范圍內光吸收的可能性就越大（誘發(fā)熒光發(fā)射的前提條件之一）。發(fā)射光的產率稱為量子產率，即發(fā)射的量子數與吸收的量子數之比（許多商用熒光染料的產率在0.1和0.9之間）。量子產率低于1是能量通過非輻射路徑（如熱或者光化學反應），而不是通過熒光的再輻射路徑損失能量的結果。下表中給出了一組特定熒光染料的熒光量子產率。請注意，有些熒光染料的量子產率似乎很低（苯），而其他則很高（熒光素和羅丹明-B）。

光源的分子消光系數、量子產率和平均發(fā)光強度（固有亮度）以及熒光壽命（激發(fā)態(tài)的持續(xù)時間）都是影響熒光發(fā)射強度和可用性的重要因素。此外，熒光染料周圍的局部環(huán)境是決定熒光發(fā)射特性的關鍵因素。環(huán)境中的溶劑粘度、離子濃度、pH值和疏水性等變量，對熒光強度和激發(fā)態(tài)的壽命都有著重要影響。

基本測量原理

• 熒光測量

熒光測量的原理是基于分子的能級結構和分子的熒光現象。利用物質在受到光激發(fā)后，部分電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后在短時間內通過非輻射躍遷或受激發(fā)射的方式，退回到基態(tài)。在這個過程中，物質釋放出能量，并以熒光的形式輻射出來，產生熒光信號。熒光信號的特征包括熒光強度、熒光壽命、熒光發(fā)射光譜等。熒光強度是熒光信號的強度，與激發(fā)光強度成正比；熒光壽命是熒光信號的壽命，與物質的性質有關；熒光發(fā)射光譜是熒光信號的波長分布，可以反映物質的組成和結構。熒光測量可以通過測量熒光信號的強度、壽命、發(fā)射光譜等特征，來對物質進行分析和研究。

在熒光測量中，使用光譜儀對樣品進行測量。熒光光譜儀可以通過調整激發(fā)波長和檢測波長，以及對儀器進行校準，來獲取樣品的熒光光譜數據。

光譜儀內部構造圖

Internal structure diagram of spectrometer

• 光致發(fā)光量子效率測量

熒光和磷光的吸收和發(fā)光過程能量圖

能級圖描述了普通有機分子的電子能級，并標示了能級間的電子躍遷。S₀、S₁和T₁分別代表基態(tài)，低單態(tài)和低三重態(tài)。光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)分子可以沿幾種躍遷路徑，包括輻射過程和非輻射過程而回到基態(tài)。輻射過程涉及了光發(fā)射，例如熒光和磷光。非輻射過程涉及內轉換和系統(tǒng)間熱釋放。輻射過程和非輻射過程相互競爭。

所謂光致發(fā)光（Photoluminescence簡稱PL），是指物體依賴外界光源進行照射，從而獲得能量，產生激發(fā)導致發(fā)光的現象。也指物質吸收光子（或電磁波）后重新輻射出光子（或電磁波）的過程。光致發(fā)光過程包括熒光發(fā)光和磷光發(fā)光。

從量子力學理論上，這一過程可以描述為物質吸收光子躍遷到較高能級的激發(fā)態(tài)后返回低能態(tài)，同時放出光子的過程。光致熒光發(fā)光是多種形式的熒光（Fluorescence）中的一種。原理圖如下圖：

熒光產生的過程

而在現階段光致發(fā)光材料的研究中，對熒光量子效率的計算非常重要，因為這是反映光致發(fā)光材料發(fā)光能力的重要特征指標。

熒光量子效率又稱熒光量子產額（quantum yield of fluorescence）或熒光效率。一般情況下，熒光量子效率、熒光量子產額與熒光效率描述等價。首先讓激發(fā)光照射到空白容器，獲得激發(fā)光譜，得總光子數。然后，在容器中放入樣品，再用激發(fā)光照射獲得未吸收光子數和發(fā)射光子數。通過單位時間（秒）內，發(fā)射光子（綠色區(qū)域）和吸收光子數（藍色區(qū)域）的比值，計算出絕對熒光量子產率（PLQY）?？梢允褂孟铝泄奖磉_：

測量樣品的量子產率有兩種方法：

1、相對量子產率測量：需要一種已知量子產率的標準品作為參照，通過對標準物和樣品進行吸光度和熒光的測量換算得到樣品的量子產率。只適用于液體樣品。

2、絕對量子產率測量：不需要標準樣品進行對比，廣泛適用于液體、薄膜和粉末樣品。在進行測量時需要積分球附件；積分球內表面涂層一般是高反射性材料，比如硫酸鋇和聚四氟乙烯。樣品表面各個方向的激發(fā)光或者是發(fā)射光進行積分球均勻化后從出射口出來，并進入到單色器中最后被檢測器檢測到。

測試絕對熒光量子產率方法

• 電致發(fā)光量子效率測量

電致發(fā)光（Electroluminescent，簡稱EL），是通過加在兩電極的電壓產生電場，被電場激發(fā)的電子碰擊發(fā)光中心，而引致電子在能級間的躍遷、變化、復合導致發(fā)光的一種物理現象。由于電致發(fā)光產品具有發(fā)光效率高、器件壽命長、響應速度快、視角特性好、色彩度強、成本價格低、可彎曲等特點，在顯示器和照明領域有非常廣闊的應用前景。

決定電致發(fā)光產品性能是否優(yōu)良的，就是電致發(fā)光器件了。我們常說到的OLED、QLED都屬于這類器件。它們主要包括五層結構：陰極、電子傳遞層、發(fā)光層、空穴傳遞層和陽極。其中發(fā)光層的材料稱為電致發(fā)光材料，OLED器件的發(fā)光層為有機分子材料，QLED器件的發(fā)光層為量子點材料。

電致發(fā)光器件結構示意

電致發(fā)光器件的EQE（外量子效率）值是決定器件封裝以后光效的重要參數之一，也是真正決定電致發(fā)光器件是否能夠商業(yè)化的重要參數之一。無論對于顯示器還是照明，從電能轉化為光能的發(fā)光效率都非常重要，其主要反映了輸入功率的利用率。發(fā)光效率越高，器件的熱損耗越小，能量利用率越高。在電致發(fā)光器件的研究中，對應的參數則為外量子效率（EQE，External Quantum Efficiency）。

現在普遍的EQE測量方法有兩種，第一種是通過亮度計測量法線方向的亮度，通過標準朗伯體分布理論計算得到器件的EQE值。該方法有嚴重的缺點：實際中器件的朗伯體分布并非標準的余弦分布，會有部分分布不均的現象，此時通過理論計算的結果會非常不準確。

光分布法測試值（實心點）與朗伯體預測值（空心點）的區(qū)別

第二種EQE的測量方法是通過積分球配件，將器件的整體光通量收集，并通過計算得到器件的EQE。該方法又有兩種測量方案，一種是將器件置于積分球球壁上，僅測量器件的前向通量，稱為2π法；一種是將器件置于積分球內部，測量器件的整體通量，稱為4π法。

積分球法EQE測試結果實例——四種顏色的OLED電致發(fā)光器

熒光測量方案

• 熒光測量

激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是熒光光譜中的兩種：

熒光激發(fā)光譜：熒光激發(fā)光譜是讓不同波長的激發(fā)光源激發(fā)熒光物質使之發(fā)生熒光，而讓熒光以固定的發(fā)射波長照射到檢測器上，然后以激發(fā)光波長為橫坐標，以熒光強度為縱坐標，所繪制的圖表示熒光物質在不同波長激發(fā)光源的激發(fā)下測得的某一波長處的熒光強度的變化情況，也就是不同波長的激發(fā)光的相對效率，即為熒光激發(fā)光譜。熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光的波長無關 。

熒光發(fā)射光譜：熒光發(fā)射光譜則是使激發(fā)光的波長和強度保持不變，而讓熒光物質所發(fā)出的熒光通過發(fā)射單色器照射于檢測器上，亦即進行掃描，以熒光波長為橫坐標，以熒光強度為縱坐標作圖，光譜曲線表示為某一固定波長的激發(fā)光源激發(fā)作用下熒光強度在不同波長處的分布情況，也就是熒光中不同波長的光成分的相對強度，即為熒光光譜，又稱熒光發(fā)射光譜。

發(fā)射光譜是固定激發(fā)波的波長，測定發(fā)射光強度與波長（有時候也測波數或者頻率等）的關系，通俗而不太嚴謹地說，發(fā)射光譜測定的是發(fā)射光的顏色。激發(fā)光譜是固定發(fā)射光的波長，測量激發(fā)光的波長與熒光強度之間的關系。如從發(fā)射光譜知道某分子最大發(fā)射波長是500nm，我們希望知道用哪個波長的激發(fā)光照射這個分子，可以獲得最大的發(fā)射強度，就可以通過測定激發(fā)光譜來實現。一般情況下，最大激發(fā)波長小于最大發(fā)射波長。實際應用中，根據我個人經驗，發(fā)射光譜用的比激發(fā)光譜要多。

熒光光譜測量首先需要明確測量樣品的類型和要求。其次，需要確定熒光光譜測量的條件和參數，如激發(fā)波長、檢測波長、積分時間等。最后，需要制定熒光光譜測量的標準操作流程和數據分析方法：

樣品類型和要求：需要明確樣品的物理化學性質、濃度、形態(tài)等，以及測量的目的和要求，如定量分析、質量分析、結構分析等。

1. 熒光光譜測量條件和參數：需要選擇合適的熒光光譜儀，確定激發(fā)波長、檢測波長、積分時間、激發(fā)光強度等參數。目前大多數熒光測量是相對測量，測量過程受設備激發(fā)光源、熒光自身的非均勻性光漂白和檢測設備的檢測限等因素的影響，導致測量數據不準確，限制了儀器之間、實驗室之間測量結果的可比性。儀器測量數據的準確性受以下6個因素影響，分別為：

   （1）光照尺寸大?。?/p>

   （2）照射到樣品的激發(fā)光強度；

   （3）光照射到樣品的均勻性；

   （4）儀器自身的分辨力；

   （5）檢測器光譜響應；

   （6）光譜分辨力。

在熒光痕量檢測中，光源的穩(wěn)定性是影響熒光測量的重要因素，關系著整個檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定及精度。將校準玻片放置在熒光顯微鏡下，測量熒光校準玻片的熒光強度，如果熒光強度發(fā)生了偏差，可以根據偏差及時校準熒光顯微鏡，不僅可以實現對熒光顯微鏡穩(wěn)定性校準； 同時還可以評估不同熒光儀器性能，實現不同儀器測量數據的可比性，提高熒光顯微鏡測量的準確性。

1. 對于復雜樣品，可能需要進行預處理，如分離、純化、稀釋等。熒光物質篩選及其光譜特性合適的熒光染料主要有 3 個標準：

   （1）熒光物質的激發(fā)波長和發(fā)射波長與所校準熒光檢測設備通道相匹配；

   （2）所選熒光物質的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜具有較大的斯托克斯位移；

   （3）熒光物質具有良好的穩(wěn)定性，即較小的光漂白。常用的熒光校準材料主要是有機熒光染料，如Cy3、Cy5、羅丹明等，由于有機染料在相對較短的時間內即可被光漂白，光穩(wěn)定性較差。量子點具有很好的光穩(wěn)定性，具有較大的斯托克斯位移，同時具有寬激發(fā)譜和窄發(fā)射譜，基于這些良好性能，我們選擇了量子點作為候選熒光染料。

2. 標準操作流程和數據分析方法：需要制定熒光光譜測量的標準操作流程，包括樣品制備、儀器操作、數據采集、數據處理等步驟。同時，需要選擇合適的數據處理方法，如基線校正、峰形分析、曲線擬合等，以及質量控制方法，如標準曲線法、內標法等。

• 光致發(fā)光量子效率測量

在開發(fā)新的發(fā)光材料過程中，提高它們的光致發(fā)光效率是至關重要的，提高發(fā)光材料的量子效率就需要精確量子效率測量技術，iSpecRad-PQY光致發(fā)光量子效率測量系統(tǒng)操作便捷，是萊森光學（LiSen Optics）專門針對器件的光致發(fā)光特性進行有效測量，可在手套箱內完成搭建，無需將樣品取出即可完成光致發(fā)光量子效率的測試。

光致發(fā)光量子效率測量系統(tǒng)

系統(tǒng)搭配包括光譜儀，帶輻射校準光源積分球，激光光源、光纖及配套治具等，萊森光學光道儀信噪比高，雜散光低，動態(tài)范用大適合不同波段和強度的激發(fā)光和發(fā)射光測量，同時，該系統(tǒng)配有強大的專用測試軟件，操作邏輯簡單，測試過程快捷方便。萊森光學iSpecRad-PQY光致發(fā)光量子效率系統(tǒng)可以支持粉末、薄膜和液體樣品的測量，適用于有機金屬復合物、熒光探針、繞料敏化型PV材料，OLED材料、LED熒光粉等領域。

熒光（液體）測量實驗實景

• 電致量子效率測量

iSpecRad-EQE電致發(fā)光量子效率測量系統(tǒng)是萊森光學（LiSen Optics）綜合發(fā)光特性測量平臺中的重要成員，可專門針對發(fā)光器件的光電特性進行有效測量。系統(tǒng)搭配包括光譜儀、帶輻射校準光源積分球、電流源表、探針臺、光纖及治具等。光譜儀具有信噪比高、雜散光低，動態(tài)范圍大等特性，適合不同波段和強度的激發(fā)光和發(fā)射光測量，可確保測量結果的準確性。同時，系統(tǒng)配有強大的專用測試軟件，操作邏輯簡單，測試過程迅速。

電致發(fā)光量子效率測量系統(tǒng)

iSpecRad-EQE電致發(fā)光量子效率測量系統(tǒng)能夠以高檢測精度對電致發(fā)光器件進行縱深測量，得到全面的電致發(fā)光效率參數（外量子效率等）以及相關的電學、輻射度學、光度學、色度學等參數；同時該系統(tǒng)集成了穩(wěn)定性測試模塊，可以對器件的老化過程進行測試，且同時得到器件老化過程的全面信息，即涵蓋了上述發(fā)光效率、電學、輻射度學、光度學、色度學等全面參數（通常的老化測試儀，僅對電流、電壓和相對亮度進行測試）。在生物熒光標記、太陽能電池、光催化、化學分析、食品檢測及活體成像等領域具有巨大的潛在應用價值。

• 總結

熒光光譜測量、光致發(fā)光量子效率測量和電致發(fā)光量子效率測量都是半導體材料光電性能測量方法，但它們的激發(fā)方式和測量原理不同，因此在實際應用中有不同的優(yōu)缺點和適用范圍。

熒光光譜測量是通過測量物質在受到激發(fā)后發(fā)射出的熒光輻射的光譜，來對物質進行分析和研究。熒光光譜測量適用于分析物質的分子結構和電子能級結構等方面，具有非接觸、快速、無損、可重復性好等優(yōu)點。但熒光光譜測量對樣品要求較高，需要樣品能夠發(fā)射熒光輻射，因此并不適用于所有物質。

 不同體積的硫酸奎寧溶液的熒光量子效率

光致發(fā)光量子效率測量是通過短脈沖激光對半導體材料進行光激發(fā)，測量電荷載流子的發(fā)射率和捕獲率，從而計算出半導體材料的量子效率。光致量子效率測量適用于半導體材料的表面和體材料的量子效率測量，具有非接觸、快速、無損、可重復性好等優(yōu)點。但光致量子效率測量對樣品要求較高，需要樣品具有良好的電學性能和光學性能，且激光參數需要精確控制。

電致發(fā)光量子效率測量是通過在外加電場的作用下，測量半導體材料的量子效率。電致量子效率測量適用于器件的量子效率測量，可以測量器件的內部量子效率，具有高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點，但需要制備器件，操作較為復雜，且需要施加電場，可能會影響到材料的性質。

綜上所述，熒光光譜測量、光致量子效率測量和電致量子效率測量各有優(yōu)缺點和適用范圍，需要根據具體的研究對象和目的來選擇合適的方法。

應用領域

熒光光譜是一種重要的分析方法，其應用領域非常廣泛。以下是熒光光譜在不同領域中的具體應用：

1. 生物分析：熒光光譜可以用于分析生物分子，如蛋白質、核酸等。熒光光譜分析可以用于生物分子的定量和質量分析，以及蛋白質和核酸的熒光標記和探針。在醫(yī)學領域，熒光光譜在生物分析方面的應用非常廣泛，如用于檢測血液中的蛋白質和其他生物分子，以及腫瘤標記物等。

濃度為 1μm 的牛血清白蛋白（BSA）溶液中的色氨酸的熒光光譜隨溫度變化的情況

溫度從 5°C 逐漸增加到 70°C，熒光光譜的強度 下降，熒光峰位置向著短波長方向藍移。各向異性或時間 分辨的各向異性熒光光譜也可以用來獲得有關蛋白的尺 寸、形狀和重新取向運動的信息。

1. 醫(yī)學診斷：熒光光譜在醫(yī)學診斷方面也有廣泛的應用。熒光光譜可以用于檢測生物標記物和藥物，以便診斷疾病和監(jiān)測治療進展。例如，熒光光譜技術被廣泛應用于心血管疾病、腫瘤、傳染病等方面的診斷。

負載Fura-2的心房細胞的細胞內鈣反應

1. 環(huán)境監(jiān)測：熒光光譜可以用于環(huán)境監(jiān)測，如檢測水中的重金屬、有機污染物等。熒光光譜技術對于水質監(jiān)測、空氣質量檢測等方面的應用也非常廣泛。

三種不同油污的光譜

1. 材料科學：熒光光譜可以用于材料表征，如熒光探針、熒光染料等。熒光光譜技術可以用于材料的表征和分析，例如，用于分析半導體材料和涂料中的成分和結構變化等。

熒光素染料的吸收/激發(fā)（藍色）和熒光（紅色）光譜

典型熒光染料的吸收-發(fā)射光譜圖

1. 食品安全：熒光光譜技術可以用于食品中有害物質的檢測，如農藥、重金屬等。熒光光譜技術對于食品質量和安全方面的監(jiān)測也有很多的應用。

不同硫胺素濃度和汞結合形成硫胺素的反應速率

除了以上的應用領域，熒光測量還可以用于研究物質的動力學過程，例如藥物分子的擴散、蛋白質的折疊等；還可以用于研究物質的微觀結構，例如膜蛋白的結構、DNA的構象等。因此，熒光測量在化學、生物、物理等多個領域都有廣泛的應用。

光致發(fā)光量子效率測量

• 無機光致發(fā)光、有機光致發(fā)光

• EL器件封裝前體

• 有機金屬復合物、絡化物化合物的測量

• 染料敏化型PV材料、OLED材料

• LED、有機EL用熒光體的量子效率測量

• 膜狀樣品的透過熒光/反射熒光的量子效率測量（非接觸式熒光粉用熒光體樣品等）

• 量子Dot、熒光探頭（探針）、生體領域、包接化合物等的熒光測量

• 色素敏化型太陽電池的量子效率測量

電致量子效率測量

• 無機/有機電致發(fā)光

• 分子薄膜EL器件

• AIE（聚集誘導發(fā)光）材料

• 量子點發(fā)光二極管（QLED）、有機發(fā)光二極管（OLED）、發(fā)光二極管（LED）、鈣鈦礦發(fā)光二極管（PeLED）等其他各種類型的電致發(fā)光器件

配置推薦：

• LiSpec-HS系列高靈敏度光譜儀 / LiSpec-HSR系列熱電制冷高性能光譜儀

LiSpec-HS400系列高靈敏度光譜儀是一款成功地把紫外可見近紅外高量子效率和高測量速度相結合的高靈敏度光譜儀，其獨有的消雜散光技術、降噪電路控制技術、再加上出眾的高量子效率探測器性能，使光譜儀的靈敏度、信噪比得到極大的提升。

LiSpec-HSR系列熱電制冷高性能光譜儀是采用了高量子效率的薄型背照制冷型面陣CCD具有非常高的科研級靈敏度，同時采用了高性能穩(wěn)定的TE制冷裝置、獨有降噪低噪聲電路控制技術，光譜儀暗噪聲極低，優(yōu)良的穩(wěn)定性，高信噪比。

• 光纖（熒光反射探頭）

采用純度很高的進口石英纖芯，光纖類型采用多模光纖，數值孔徑為0.22，也可以為用戶提供如NA=0.12、0.15/0.26/0.37等數值孔徑的多模光纖

• 熒光比色皿支架

LS-CUV-FL帶有兩個成90°角的準直透鏡，適合熒光測量，另外兩個端口裝有鍍鋁膜的SiO₂反射鏡（LS-CUV-EL-FL-MIRROR）。LS-CUV-FL-ALL有4個準直透鏡，構成兩個垂直光路。

• iSpecRad-PQY熒光量子效率積分球

通用的熒光量子效率積分球有三個開口，分別是光入射口，樣品口和光出射口。光入射口置有準直鏡，將激發(fā)光源準直照射到樣品，光出射口內置有擋板，防止入射光直接出射。常用的樣品口配套有熒光比色皿支架，可用于液體、粉末、固體等樣品測量。